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Date:
2020-04-20
[Abstract] Expression levels of cellular proteins can be affected by various perturbations, such as genetic knockout of interactors, drug treatments or cell stress. To specifically measure the effects on protein levels post-synthesis under different experimental conditions, it is important to compensate for transcriptional and other upstream changes. Here, we provide a protocol for a dual-fluorescence flowcytometry-based assay to determine protein levels. The protein of interest is genetically linked to enhanced GFP (eGFP) followed by a viral 2A self-cleaving peptide sequence and mCherry. As a result, translation of the reporter construct leads to two fluorescent protein products from the same mRNA template, which enables unambiguous protein expression analysis with normalization across samples.
[摘要] [摘要 ] 表达水平的细胞蛋白质可受各种扰动，如基因敲除交互件，药物治疗小号或细胞压力。具体测量对蛋白质水平合成后在不同的实验条件，重要的是要补偿对于转录等上游的变化在这里，我们提供了一个协议为双- 荧光流。流式细胞仪为基础的检测，以确定蛋白质水平目的蛋白是遗传关联增强GFP（EGFP 其次是病毒2A自身切割肽）序列和mCherry结果，报告子构建体的翻译会导致来自同一mRNA模板的两个荧光蛋白产物，这使得能够进行明确的蛋白表达分析，并对整个样品进行归一化处理。
背景 ] 合成和维护的Cellu 拉尔在p- Roteins取决于多进程，从转录调节，处理和降解mRNA中翻译，折叠，本地化，翻译后修饰和蛋白质降解（沃格尔而且马科特，2012） 。具体研究的。在蛋白水平合成后的细胞扰动的影响，这一点很重要，以弥补变异上游步骤蛋白表达在这里，我们提供了一个协议的双- 荧光流术为基础的检测，以确定蛋白质水平处于稳定状态如前所述（Itakura 等人，2016; Chitwood 等人，2018; Ngo 等人，2019）。目的蛋白在基因上与增强的GFP（eGFP ）融合，随后是病毒2A自切割肽序列和一个第二种荧光蛋白，mCherry （图1），由于在2A s时核糖体跳过了肽键，融合构建体的翻译产生了两种蛋白质产物，其比例为1：1。ite：与eGFP 和mCherry ...
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