| A Flow-assay for Farnesol Removal from Adherent Candida albicans Cultures
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Author:
Date:
2017-10-05
[Abstract] Here, we describe a protocol for a continuous flow system for C. albicans cultures growing adherent to a plastic surface. The protocol was adapted from a previous method established to simulate blood flow on endothelial cells (Wilson and Hube, 2010). The adapted protocol was used by us for the removal of molecules in C. albicans supernatants, especially farnesol, which accumulate over the time course of incubation and cannot be specifically depleted. The system used, however, allows various applications including the simulation of physiological flow conditions. Several example applications are given on the manufacturer’s website (https://ibidi.com/perfusion-system/112-ibidi-pump-system.html ...
[摘要] 在这里，我们描述了用于连续流系统的协议。 白色念珠菌生长粘附在塑料表面上的培养物。 该方案根据建立以模拟内皮细胞上的血液流动的先前方法改编（Wilson和Hube，2010）。 我们使用适应方案去除C中的分子。 白色念珠菌上清液，特别是法呢醇，其在孵育的时间过程中积累并且不能被特异性地耗尽。 然而，所使用的系统允许各种应用，包括模拟生理流动条件。 制造商网站上给出了几个示例应用程序(https://ibidi.com/perfusion-system/112-ibidi-pump-system.html).
【背景】法尼醇是人类致病真菌白色念珠菌中的酵母 - 菌丝转移（Hornby等人，2001）的有效抑制剂，并且还促进了酵母生长的逆转预制长丝（Lindsay等人，2012）。群体感知分子（QSM）快速积聚在白念珠菌EED1缺失株的上清液中，并促进突变体（Polke等人）的反向形态发生和菌丝维持缺陷>，2017）。由于我们无法阻止法呢醇的合成（Polke等人，2017），我们使用了ibidi ®泵系统，通过单向去除上清液中累积的QSMs流。流动应用以及在孵育期间的恒定的培养基更换在C中显着延长了丝状化。白色念珠菌eed1Δ突变体。这表明QSM积累的成功去除，并且提供了在C中的菌丝维持和法呢醇信号之间的直接联系。白色假丝酵母。用于此协议（ibidi ...
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| Transient Transfection-based Fusion Assay for Viral Proteins
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Author:
Date:
2017-03-05
[Abstract] Membrane fusion is vital for entry of enveloped viruses into host cells as well as for direct viral cell-to-cell spread. To understand the fusion mechanism in more detail, we use an infection free system whereby fusion can be induced by a minimal set of the alphaherpesvirus pseudorabies virus (PrV) glycoproteins gB, gH and gL. Here, we describe an optimized protocol of a transient transfection based fusion assay to quantify cell-cell fusion induced by the PrV glycoproteins.
[摘要] 膜融合对于将包膜病毒进入宿主细胞以及直接病毒细胞到细胞传播至关重要。为了更好地了解融合机制，我们使用无感染系统，可以通过最小的α疱疹病毒伪狂犬病病毒（PrV）糖蛋白gB，gH和gL诱导融合。在这里，我们描述了基于瞬时转染的融合测定的优化方案，以定量由PrV糖蛋白诱导的细胞 - 细胞融合。
背景 膜融合对于包膜病毒的进入和扩散至关重要。许多包膜病毒只需要一种或两种病毒蛋白来介导宿主细胞的附着和膜融合，分子机制也被很好地理解（Harrison，2015）。相比之下，疱疹病毒使用需要受体结合蛋白的更复杂的机制和由gB和异二聚体gH / gL复合物组成的核心融合机构用于感染性进入。导致疱疹病毒包膜与细胞膜融合的机制尚不完全清楚。疱疹病毒进入和传播的分子基础的详细知识对于针对各种疾病的有效对策是重要的。通过研究瞬时表达相关蛋白质的细胞的细胞融合活性来帮助更好的理解。已经开发了不同的模型系统，其中在不存在感染的情况下，开发了由糖蛋白gB和gH / gL和受体结合gD表示的最小的核心融合机制的融合，例如，对于1型单纯疱疹病毒和2（HSV-1和2 [Turner等人，1998; Muggeridge，2000; ...
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| Multiplexed GuideRNA-expression to Efficiently Mutagenize Multiple Loci in Arabidopsis by CRISPR-Cas9
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Author:
Date:
2017-03-05
[Abstract] Since the discovery of the CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-associated protein (Cas) as an efficient tool for genome editing in plants (Li et al., 2013; Shan et al., 2013; Nekrasov et al., 2013), a large variety of applications, such as gene knock-out, knock-in or transcriptional regulation, has been published. So far, the generation of multiple mutants in plants involved tedious crossing or mutagenesis followed by time-consuming screening of huge populations and the use of the Cas9-system appeared a promising method to overcome these issues. We designed a binary vector that combines both the coding sequence of the codon optimized Streptococcus pyogenes Cas9 nuclease under the control of the Arabidopsis thaliana ...
[摘要] 自从发现CRISPR（聚集的定期交织的短回文重复） - 相关蛋白（Cas）作为植物基因组编辑的有效工具（Li等人，2013; Shan等人已经出版了诸如基因敲除，敲入或转录调控等各种各样的应用，例如，2013; Nekrasov等人，2013）。到目前为止，植物中多种突变体的产生涉及繁琐的杂交或诱变，随后大量人群的耗时筛选，Cas9系统的使用似乎是有希望的方法来克服这些问题。我们设计了一种二元载体，其结合了在拟南芥UBIQUITIN10（UBQ10）启动子和引导RNA（gRNA）控制下的优化的化脓性链球菌（Caspase）密码子的编码序列）由 A驱动的表现盒。拟南芥U6 - 启动子，用于在拟南芥中进行有效的多重编辑（阎等人，2016年）。在这里，我们描述了一个逐步的方案，以经济有效的方式生成含有多个gRNA的二元载体和基于经典克隆方法的Cas9核酸酶。背景 RNA引导的Cas9系统源于针对外源DNA的细菌防御系统（Sorek等人，2013）。由于其高效率，易于处理和多重编辑的可能性，已经被认为是基因组编辑的选择方法。通常，Cas9基因编辑系统涉及单个合成RNA分子，其指导Cas9蛋白质靶向所需DNA位点以进行基因组修饰或转录控制的gRNA。 gRNA-Cas9复合物通过gRNA-DNA配对识别靶向的DNA，并需要存在原始相邻基序（PAM）。 ...
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