| Isolation of the Dot/Icm Type IV Secretion System Core Complex from Legionella pneumophila for Negative Stain Electron Microscopy Studies
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Author:
Date:
2017-04-20
[Abstract] Legionella possesses a pivotal secretion machinery to deliver virulence factors to eukaryotic host cells. In this protocol, we describe the procedure for isolation of the native core complex of the Dot/Icm type IV secretion system from L. pneumophila aiming to perform biochemical and transmission electron microscopy analyses.
[摘要] 军团菌具有关键的分泌机制，以将毒力因子递送至真核宿主细胞。在本协议中，我们描述了从L / L分离Dot / Icm IV型分泌系统的天然核心复合物的步骤。肺炎支原体旨在进行生物化学和透射电子显微镜分析。
嗜肺军团菌是革兰氏阴性细菌病原体，其导致被称为退伍军人病的肺部感染（Fields等人，2002）。 L。嗜肺杆菌利用由 dot / cm 基因编码的IV型分泌系统（T4SS）将大约300种细菌蛋白转运到其真核宿主细胞质中以劫持细胞过程（Hubber和Roy， 2010）。由超过20种蛋白组成，T4SS是建立在细菌内膜和外膜上的纳米机器（Nagai和Kubori 2011; Kubori和Nagai 2016）。 Dot / Icm T4SS的核心复合物是系统的生物化学稳定部分，并形成桥接内膜和外膜的输送导管（Kubori等人，2014）。核心复合物由至少五种蛋白质组成;三种外膜相关蛋白，DotC，DotD和DotH，以及两种内膜蛋白DotF和DotG（Vincent等人，2006）。基于来自鼠伤寒沙门氏菌的另一种细菌纳米机械的III型分泌系统的生物化学分离方法（Kubori等人，1998; Marlovits等人， ...
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| Analytical Gel Filtration for Probing Heavy Metal Transfer between Proteins
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Author:
Date:
2016-08-05
[Abstract] Heavy metals can cause damage to biomolecules such as proteins and DNA in multiple ways. Cells therefore strive for keeping intracellular (heavy) metal ions bound to specific proteins that are capable of handling detoxification, export or integration as cofactors. Metal binding proteins usually provide specific coordination sites that bind certain ions with ultrahigh affinity, with the thermodynamic driving force being the stability of organometallic complexes. However, the metal binding properties of these proteins can be highly variable. Therefore the transfer of specific ions between separate proteins or even between distinct binding sites located on one and the same protein does not always follow affinity gradients, but depends on particular protein interactions that are difficult to ...
[摘要] 重金属可以以多种方式对生物分子例如蛋白质和DNA造成损害。因此，细胞努力保持细胞内（重）金属离子结合到能够处理解毒，输出或整合作为辅因子的特定蛋白质。金属结合蛋白通常提供结合某些离子的特异性配位位点，具有超高的亲和力，热力学驱动力是有机金属配合物的稳定性。然而，这些蛋白质的金属结合性质可以是高度可变的。因此，在分开的蛋白质之间或甚至在位于同一蛋白质上的不同结合位点之间的特异性离子的转移不总是遵循亲和梯度，而是取决于难以预测的特定蛋白质相互作用。我们建立了一种适合探测两种蛋白质之间的金属转移的方法，只要这些蛋白质可以进行纯化和体外处理。它由金属负载，共孵育和金属交换蛋白的分离，随后确定结合金属含量。该方法通过我们探测膜 - 外在金属结合结构域MBD2和来自大肠杆菌的铜输出ATP酶的跨膜结构域的膜 - 外部金属结合结构域MBD2之间的铜（I）转移的实验数据来举例说明（Drees < em=""> 。，2015）。
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| Preparation of Arabinogalactan Glycoproteins from Plant Tissue
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Author:
Date:
2013-10-05
[Abstract] This supplements an earlier protocol (Popper, 2011) for the extraction and assay of cell surface arabinogalactan proteins (AGPs). These highly glycosylated glycoproteins (~95% carbohydrate) contain numerous glycomodules with paired glucuronic acid residues that bind Ca2+ in a pH dependent manner (Lamport and Varnai, 2013). Classical AGPs comprise the bulk of cell surface glycoproteins and are thus integral components of a Ca2+ oscillator involved in a signalling pathway where calcium is a “universal signalling currency” analogous to ATP as the universal energy currency. The central role of these peripheral glycoproteins is thus reason enough for their further study. However, problems arise due to the extensive glycosylation and its apparent microheterogeneity ...
[摘要] 这补充了用于细胞表面阿拉伯半乳聚糖蛋白（AGP）的提取和测定的早期方案（Popper，2011）。这些高度糖基化的糖蛋白（〜95％碳水化合物）含有许多具有以pH依赖性方式结合Ca 2+ 2+的成对葡萄糖醛酸残基的糖模块（Lamport和Varnai，2013）。经典AGP包含大量细胞表面糖蛋白，因此是参与信号传导途径的Ca 2+ 2+振荡器的整体组分，其中钙是类似于作为通用能量货币的ATP的"通用信号传导货币"。因此，这些外周糖蛋白的中心作用是足以进行进一步研究的理由。然而，由于广泛的糖基化及其明显的微不均一性，通常假定排除简单的还原剂方法而出现问题。在这里，我描述了基于其与β-D-葡糖基或半乳糖基的特异性相互作用的经典AGP的简单部分纯化Yariv试剂，一种合成的重氮染料，其在中性pH的盐溶液中沉淀AGP作为不溶性复合物。 ...
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